Absolutní kvantifikace
Při absolutní kvantifikaci se používá standardní křivka se standardy o známé koncentraci. Koncentrace je vyjádřena v počtu kopií. Vzorky o neznámé koncentraci jsou porovnány se standardy o známé koncentraci a koncentrace je intrapolována ze standardní křivky.
POZOR: Pokud je standardní křivka nepřesná nebo vytvořena z nevhodných standardů, pak i počty kopií získané ze standardní křivky jsou nespolehlivé. Při nemožnosti vytvořit vhodný standard, je výhodné použít jiné metody, digitální PCR.
PŘÍKLAD: qPCR KAPA Library Quantification Kit pro kvantifikaci NGS knihoven
Relativní kvantifikace
Pomocí relativní kvantifikace analyzujeme změny genové exprese v určitém vzorku (např. čas 48 hodin) v porovnání s referenčním vzorkem (např. čas 0 nebo zdravá kontrola, atd.). Všechny vzorky jsou většinou normalizovány k referenčním genům (viz. referenční geny). Normalizovaná kontrola s normalizovaným vzorkem je porovnána a výsledkem je násobek exprese (fold change), např. exprese genu X ve vzorku ovlivněným léčivem je 5x nižší než expese genu X v kontrolního vzorku, který nebyl ovlivněn.
Výběr vhodných referenčních genů
Cílem genově expresních studií je zjistit zda exprese genu, který vás zajímá, stoupá nebo klesá. Proto cílový gen musíme relativně vztáhnout ke stabilně se exprimujícímu genu (referenčnímu genu či genům), který pak může sloužit jako základna. Takový gen by měl být stabilní za všech podmínek VAŠEHO experimentu. A pro tento účel musí být také validován pro každý nový, specifický experiment. Neexistuje žádný univerzální referenční gen.
Referenční geny jsou endogenní kontrolou, a proto mohou „opravit“ i nestejné množství RNA, které přidáte do reverzní transkripce. Pokud je referenční gen v duplexu s cílovým genem (v jedné reakci), může „opravit“ i pipetovací chyby v qPCR.
Stabilitu potencionálních referenčních genů lze otestovat na panelu referečních genů s minimálně deseti reprezentativními vzorky pro každou experimentální podmínku, softwarem NormFinder. Nabízíme testování vhodných referenčních genů s pomocí referenčních panelů pro lidské nebo myší vzorky obsahující 12 potencionálních referenčních genů.
Kontrola kontaminace genomovou DNA
Při izolaci RNA je téměř nemožné vyizolovat čistou RNA bez jakékoliv kontaminace genomovou DNA. Po reverzní transkripci není možné rozeznat kontaminující genomovou DNA od cDNA, což vede ke generování falešně pozitivních výsledků a špatné kvantifikaci RNA.
Jakými způsoby se lze zbavit genomové DNA:
- DNasováním po či při izolaci
- RT- kontrola pro každý vzorek a následný odpočet genomové DNA (software GenEx)
- ValidPrime kontrola a následný odpočet genomové DNA (software GenEx)
- Navržení primerů přes hranice intronu (nemusíme se zbavit pseudogenů)
Obr: Příklad špatné kvantifikace RNA kontaminované gDNA
Zkontrolujeme kvalitu vašeho preparátu s pomocí valid primu.
Validace nových primerů a prób
Po zakoupení primerů či prób od jakékoliv společnosti zabývající se primer designem nemusíte dostat všechny informace, které jsou nutné pro submitování publikace do vědeckého časopisu.
Nabízíme kompletní prověření Vašich primerů a prób pro qPCR nebo dPCR podle MIQE pravidel:
- Specificita: pomocí elektroforetického gelu a meltingového profilu
- Optimizace annelingové teploty primerů a prób
- Změření efektivity primerů a zjistění dynamického rozsahu reakce (s pomocí carrieru)
- Na vyžádání změření limitu kvantifikace či detekce
- Zahrnutí všech kontrol: NTC, valid prime či RT-, kalibrační kontroly, pozitivní či negativní kontrola
- Validace multiplexové reakce
Obr. Příklad sériového ředění pro zjištění efektivity primerů
Kontrola inhibice v RT nebo v qPCR
Inhibice v reverzní transkripci a během qPCR reakce způsobují chybné biologické výstupy. Inhibitory v reakci způsobí částečné zpomalení reakce až její úplné zastavení. Inhibice v reakci se nedá nijak odpočítat či přepočítat, lze ji pouze detekovat. Vzorek, který je inhibovaný by se měl dostatečně naředit, pokud to koncentrace vzorku dovolí. Pokud je vzorek inhibován a jeho koncentrace je nízká, jediným řešením je nová izolace nukleových kyselin.
Inhibitory v reakci mohou pocházet:
- Ze vzorku (tkáňově nebo vzorkově specifická inhibice), například hemoglobin v krvi
- Z fixativa, ve kterém se tkáň uchovává, například FFPE
- Z použité izolační metody, například trizol nebo chemikálie použité pro uchovávání nukleových kyselin jako EDTA, glykogen
- Z reverzní transkripce. Inhibiční je vysoká koncentrace RT enzymu nebo Taq DNA polymerázy, která se vnese do reakce s vyšším objemem RNA
- Z interakce specifického qPCR templátu se specifickou próbou nebo primerem. Například při příliš velké koncentraci próby v reakci
Pomůžeme Vám zkontrolovat inhibici sériovým ředěním či spikem. A navrhneme spolehlivé ředění pro RT nebo qPCR reakci.
