OMICS Genomika

OMICS Genomika

RNDr. Štěpánka Hrdá

RNDr. Štěpánka Hrdá — Vedoucí laboratoře

Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy

O nás

CF OMICS – GENOMIKA poskytuje servisní služby v oblasti sekvenace DNA a fragmentační analýzy DNA. S klasickým Sangerovým sekvenováním a metodami fragmentační analýzy máme dlouholeté zkušenosti, samostatná Laboratoř sekvenace DNA vznikla na Přírodovědecké fakultě UK již v roce 2003 

Stránky laboratoře sekvenace DNA naleznete ZDE

Dále nabízíme:

  • čtečku čipů (microarray scanner) Axon GenePix
  • služby sekvenování druhé generace (NGS, Next-generation sekvenování) na platformě MiSeq, Illumina.
  • kontrolu kvality DNA a RNA a knihoven pro NGS pomocí spektrofotometru Nanodrop, fluorometru Quantus, Bioanalyzéru Agilient a metodami qPCR.
  • přípravu některých typů knihoven pro NGS (v současné době máme k dispozici TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit, Illumina).

 

Aktuality

Sangerovo sekvenování DNA

Nabízíme sekvenaci plasmidů a PCR produktů zahrnující sekvenační reakci a analýzu na genetickém analyzátoru ABI 3500 Life Technologies.

Vzorky k analýze lze nechávat přímo na recepci Biocev ve sběrné schránce připevněné na zdi. Další sběrné místo je na Přírodovědecké fakultě UK ve Viničné 7 ve II. suterénu (označená lednička na chodbě vedle výtahu vpravo). Vzorky lze též posílat poštou na adresu: Štěpánka Hrdá, Core facility – Genomika, PřF UK, Biocev, Průmyslová 595, Vestec, 252 50.

Opakované analýzy na genetickém analyzátoru provádíme zdarma. Samotnou sekvenační reakci nelze opakovat, připravené vzorky stačí na jednu sekvenační reakci a při jejím selhání je nutno zaslat nové vzorky.

Výsledky odesíláme e-mailem ve formatu *.ab1 (chromatogram) a *.seq většinou do dvou pracovních dnů.

 

Pravidla pro přípravu vzorků:

  • Vzorky připravujte do 0,2 ml tenkostěnných mikrozkumavek, do stripů nebo do platíčka (pipetujte prosím vertikálně, viz. obrázek).

Postup sekvenování

  • Zvláště při větším počtu jednotlivých zkumavek použijte pořadová čísla z průvodky a zkumavky vyrovnejte do stojánku, na karton či podobně (stojánky samozřejmě vracíme, stačí si je podepsat a vyzvednout).
  • Celkový objem vzorku je 8 μl = 5 pmol jednoho primeru (Tm 50-55°C opt., Tm 45-72°C max.) + DNA v množství 5ng/100pb u PCR produktů nebo 3ng/100pb plasmidové DNA (započítává se celá délka plasmidu, odpovídá to asi 100-200ng DNA do reakce, max. však 300ng u velkých plasmidů) + voda (kvalitní, v žádném případě TE pufr – blokuje reakci). Pozor – navyšování množství DNA vede i k navyšování nečistot ve vzorku a sekvenační reakce pak může být blokována! V případě problémů můžete zaslat DNA a primery zvlášť – přeměříme koncentraci a čistotu a namícháme vzorek sami.
  • Často používané primery můžeme do reakce přidat, v tom případě připravte vzorek do objemu 7 μl.
  • Vzorek pro sekvenaci musí být zbaven veškerých nečistot! Pro plasmidy je nejvhodnější použít miniprep kit. Problém může způsobit ethanol ve vzorku, takže je kolonku potřeba před elucí do vody 2x stočit a pořádně odvětrat (5 min). PCR produkty přečistěte buď pomocí kolonek nebo ethanolovou precipitací. Sami máme výbornou zkušenost se směsí na přečištění PCR produktů ExoSAP-IT™ a podobných produktů.
  • Pokud sekvenujete poprvé, začněte s malým počtem vzorků. S menším počtem začínejte i nové série, např. po delší době nebo s novými primery. Nejčastější problémy vznikají z důvodu nevhodně zvoleného primeru a špatné koncentrace či čistoty templátu. Návod na řešení nejčastějších problémů při sekvenaci najdete ZDE.
  • Průvodku ke vzorkům na sekvenační reakci a analýzu (Průvodka-reakce+analýza), nebo pouze na sekvenační analýzu (Průvodka-analýza) zasílejte na adresu seqlab@natur.cuni.cz
  • Průvodku, sáček se vzorky a předmět e-mailu označte stejně, a to zkratkou jména a datem (např. Štěpánka Hrdá – STH010112). Zkumavky se vzorky označujte zkratkou a pořadovým číslem podle průvodky (např. sth1). Názvy vzorků v průvodce mohou být jakékoli, musí ale začínat zkratkou jména (např. STH), smí obsahovat pouze povolené znaky -_ ., a nesmí obsahovat mezeru.
  • Pokud máte další požadavky, např. spěcháte na výsledky, chcete výsledky na jinou adresu, požadujete speciální podmínky (vyšší/nižší teplotu nasedání, možnou přítomnost vlásenky nebo HisTag sekvence, problémy při předchozí sekvenaci podobného vzorku, bisulfitové sekvenování, polyúseky, použití BigDye® Terminator v1.1 apod.), zapište je jak do průvodky, tak i do emailu.
  • Do průvodky nezapomeňte zmínit délku PCR fragmentu, respektive optimální požadovanou délku přečtené sekvence insertu (do 400 bazí, do 700 bazí, co nejvíc) a také velikost vektoru.

Vybavení laboratoře

Bioanalyzér 2100, Agilent

Spektrofotometr Nanodrop 2000 UV-Vis spectrophotometr, Thermo Scientific

MiSeq, Illumina

3500 Genetic Analyzer, Life Technologies

3130xl Genetic Analyzer, Life Technologies

Fluorometr Quantus, Promega

Vybavení

Naše přístroje

Bioanalyzér 2100, Agilent

Bioanalyzér 2100, Agilent

Zařízení na kontrolu kvality nukleových kyselin.

k dispozici jsou kity:

a) High Sensitivity DNA kit – pro kontrolu kvality DNA fragmentů a DNA knihoven ve velikosti 50-7000 bp. Tento kit obzvlášť slouží ke kontrole kvality a monitorování kritických kroků při přípravě knihoven pro NGS. Výhodou je vysoké citlivost (detekce už 5 pg/µl) a minimální spotřeba materiálu (pouze 1 µl vzorku).

b) DNA 12000 – pro analýzu dsDNA fragmentů od 100-12000 bp

c) RNA 6000 Nano – pro analýzu celkové RNA a mRNA v koncentraci 25-500 ng/µL. Poskytuje informace o stupni degradace celkové RNA (RIN).

 

Přístroj je umístěn v místnosti M1.023.

Spektrofotometr Nanodrop 2000 UV-Vis spectrophotometr, Thermo Scientific

Spektrofotometr Nanodrop 2000 UV-Vis spectrophotometr, Thermo Scientific

Spektrofotometr pro rychlou kontrolu kvantity a kvality DNA a RNA.

  • potřeba jen 1,5 – 2 ul
  • použití vlastních špiček
  • přístroj je na internetu

umístění v M1.023, na vyžádání zapůjčíme přístupovou kartu

Fluorometr Quantus, Promega

Fluorometr Quantus, Promega

Přístroj na kontrolu kvantity nukleových kyselin.

k dispozici jsou kity:

  • dsDNS,
  • ssDNA,
  • RNA

umístění v M1.023

LightCycler 480 Real-TimePCR, Roche

LightCycler 480 Real-TimePCR, Roche

kontrola kvantity DNA knihovny pro Next-Generation sekvenování metodou qPCR pomocí NEBNext® Library Quant Kit for Illumina®

ve spolupráci s laboratoří Doc. Mgr. Pavla Stopky, Ph.D.

umístění v A2.037

M220 Focused-ultrasonicator™, Covaris

M220 Focused-ultrasonicator™, Covaris

Přístroj slouží k fragmentování DNA pro Next-Generation sekvenování.

umístění v M1.023

Čtečka čipů GenePix 4000B, Axon

Čtečka čipů GenePix 4000B, Axon

Čtečka pro detekci fluorescenčních signálů z DNA čipů.

Přístroj je provozován ve spolupráci s laboratoří Prof. Zdeny Palkové, Ph.D.

umístění v L1.009

Ceník

Curabitur aliquet quam id dui posuere blandit. Curabitur non nulla sit amet nisl tempus convallis quis ac lectus. Curabitur non nulla sit amet nisl tempus convallis quis ac lectus. Vivamus magna justo, lacinia eget consectetur sed, convallis at tellus. Nulla porttitor accumsan tincidunt. Sed porttitor lectus nibh.

 

stáhnout ceník

Publikace

2017

Bhattacharyya T, Gregorova S, Mihola O, Anger M, Sebestova J, Denny P, Simecek P, Forejt J.: Mechanistic basis of infertility of mouse intersubspecific hybrids. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Jan 17.

Youngson N.A., Epp T., Roberts A.R., Daxinger L., Ashe A., Huang E., Lester K.L., Harten S., Kay G.F., Cox T., Matthews J.M., Chong S. and Whitelaw E.: No evidence for cumulative effects in a Dnmt3b hypomorph across multiple generations. 2013. Mammalian Genome.

Laššuthová P, Gregor M, Sarnová L, Machalová E, Sedláček R, Seeman P: Clinical, In Silico, and Experimental Evidence for Pathogenicity of Two Novel Splice Site Mutations in the SH3TC2 Gene. J Neurogenet 2012 26(3-4): 413-20. [pubmed] [doi]

2016

Kasparek P, Krenek P, Buryova H, Suchanova S, Beck IM, Sedlacek R: Transgenic mouse model expressing tdTomato under involucrin promoter as a tool for analysis of epidermal differentiation and wound healing. Transgenic Res 201221(3): 683-9. [pubmed] [doi]

Fafilek B, Krausova M, Vojtechova M, Pospichalova V, Tumova L, Sloncova E, Huranova M, Stancikova J, Hlavata A, Svec J,Sedlacek R, Luksan O, Oliverius M, Voska L, Jirsa M, Paces J, Kolar M, Krivjanska M, Klimesova K, Tlaskalova-Hogenova H,Korinek V: Troy, a Tumor Necrosis Factor Receptor Family Member, Interacts With Lgr5 to Inhibit Wnt Signaling in Intestinal Stem Cells. Gastroenterology 2012. [pubmed] [doi]

Jirouskova M, Zbodakova O, Gregor M, Chalupsky K, Sarnova L, Hajduch M, Ehrmann J, Jirkovska M, Sedlacek R: Hepatoprotective Effect of MMP-19 Deficiency in a Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis. PLoS One 2012 7(10): e46271. [pubmed] [doi]