Gene Core – Kvantitativní a digitální PCR

Gene Core – Kvantitativní a digitální PCR

Ing. Lucie Langerová

Ing. Lucie Langerová — Vedoucí laboratoře

O nás

BIOCEV – Gene Core je jedním z nejlépe vybavených poskytovatelů služeb v oblasti genové exprese ve střední Evropě. Máme bohaté zkušenosti s kontrolou kvality experimentu (RNA/DNA spike, ValidPrime, interplate kalibrátor, kvalita RNA/DNA), v single cell analýze (ALS Cellcelector), vysokokapacitní a digitální PCR (Fluidigm BioMark, BioRad QX200 Droplet digital PCR systém) i v přípravě NGS knihoven.

Klademe důraz na kontrolu kvality, která je v experimentech často opomíjena. Efektivní kontrola kvality spočívá především ve využití molekulárních nástrojů pro kontrolu kontaminace, genomického pozadí i kvality RNA. Zabýváme se i vývojem těchto metod, které usnadňují a zpřesňují analýzu genové exprese a to až na úroveň jednotlivých buněk (ΔAmp).

Kromě konvenčních analýz qPCR se zaměřujeme i na analýzu jednotlivých buněk a multianalytický přístup. Společně s profilováním genové exprese analýzou DNA/RNA/protein z jednoho vzorku a to až na úroveň jedné buňky tak nabízíme komplexní nástroj ke zmapování exprese ve vzorku pro charakterizaci typů buněk, stanovení stupně diferenciace i ke studiu jejich patologického stavu.

Nově zavádíme metody pro přípravu experimentálního designu RNA-Seq knihoven, kde efektivní protokol představuje prvotní předpoklad pro úspěšný projekt. A také novou ultra sensitivní techniku pro analýzu malých molekul RNA (microRNA). Základem nové metody, nazvané Two-tailed PCR je inovativní, patentově chráněná struktura DNA-oligonukleotidu sloužícího pro záchyt molekul microRNA. Díky svým dvou vazebným místům zaručuje mimořádnou kombinaci sensitivity a specificity.

https://academic.oup.com/nar/article/3958703/Two-tailed-RT-qPCR-a-novel-method-for-highly

Aktuality

Akce

Služby

BIOCEV – Gene Core je jedním z nejlépe vybavených poskytovatelů služeb v oblasti genové exprese ve střední Evropě.

Máme bohaté zkušenosti s kontrolou kvality experimentu (RNA/DNA spike, ValidPrime, interplate kalibrátor, kvalita RNA/DNA), v single cell analýze (ALS Cellcelector), vysokokapacitní a digitální PCR (Fluidigm BioMark, BioRad QX200 Droplet digital PCR systém) i v přípravě NGS knihoven.

Služby

01

Biostatistické služby a experimentální design

02

Izolace jednotlivých buněk

03

Izolace nukleových kyselin

04

Kontrola kvality a kvantity nukleových kyselin

05

Reverzní transkripce

06

Kvantitativní real-time PCR

07

Vysokokapacitní qPCR: BioMark (Fluidigm)

08

Digitální PCR

09

Speciální aplikace: Single cell qPCR analýza

10

Automatizace

Vybavení

Naše přístroje

The AVISO CellCelector (Automated Lab Solutions)

The AVISO CellCelector (Automated Lab Solutions)

Umožňujeme využití přístroje CellCelector, který slouží pro automatickou detekci, citlivou izolaci a přesný přenos jednotlivých buněk, buněčných kolonií nebo částí tkáně. Tento přístroj lze zarezervovat pouze s operátorem. Nutno zamluvit 48 hodin předem.

další informace


video: www.youtube.com/watch?v=PEMR2XxMXdA

2100 Bioanalyzer (Agilent)

2100 Bioanalyzer (Agilent)

Agilent je automatická mikrofluidní platforma, která umožní nahrazení všech kroků klasické elektroforézy jako tvorba gelu, barvení, odbarvování, detekce bandů a zobrazení. Pro celou analýzu, která charakterizuje 11-12 vzorků do 40 minut je potřeba pouze 1.5- 2 µl vzorku RNA nebo DNA. Součástí analýzy je i detailní report. Kvalitu RNA určí RIN (RNA Integrity Number). RIN je číslo od 1 do 10, je numerické označení pro integritu RNA.

Čipy pro měření kvality RNA jsou k dispozici v CF.

Další informace

Video: www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106

www.youtube.com/watch?v=Bu4bGb85SGI

 

LightCycler 480 System (Roche)

LightCycler 480 System (Roche)

Cyklér pro kvantitivní real-time PCR od firmy Roche. 96  a 384 jamkové destičky Roche jsou k dispozici v CF. Přístroj lze používat samostatně po zaškolení. V CF lze zakoupit mastermixy pro RT-qPCR.Službu lze zkombinovat s automatickým napipetování 384 jamkové destičky přístrojem Epmotion P5073 (Eppendorf).

Vlastnosti LC480:

  • Zdroj světla: Xenonová lampa
  • Detekce: CCD kamera
  • Excitační filtry: 440 nm, 465 nm, 498 nm, 533 nm, 618 nm
  • Emisní filtry: 488 nm, 510 nm, 580 nm, 610 nm, 640 nm, 660 nm
  • Stříbrný termální blok
  • LightCycler 480 Software poskytuje víceúčelové řešení pro většinu bězných real-time PCR aplikací
  • High Resolution Melting Analysis

 

V CF můžete zakoupit:

  • 1x destička 384 + folie: 221 bez DPH
  • 1x destička 96 + folie: 120 bez DPH

 

Další informace:

Video: www.youtube.com/watch?v=FwPzrFN9eV4

QX200 droplet digital PCR system (Bio-Rad)

QX200 droplet digital PCR system (Bio-Rad)

Digitální PCR systém poskytuje absolutní počty DNA nebo cDNA molekul bez nutnosti vytvoření standardní křivky. Systém funguje pro všechny PCR aplikace s mastermixem EvaGreen nebo mastermixem pro próby. Materiál k dispozici v CF. Přístroj lze používat samostatně po zaškolení.

Veškerý materiál pro ddPCR je k zakoupení v CF.

Nutno rezervovat C1000 před ddPCR na 2 hodiny.

Nabízíme kvantifikaci s EvaGreenem, s probama a kvantifikaci NGS knihoven.

Pro různý počet vzorků se cena různí: 8, 16, 48, 24.

Další informace

VIDEO 

Qubit® 2.0 Fluorometer (life Technologies)

Qubit® 2.0 Fluorometer (life Technologies)

The Qubit® 2.0 Fluorometr umožňuje přesnou kvantifikaci DNA, RNA a proteinů s využitím specifického fluorescenčního značení. Umožňuje kvantifikace velmi nízkých koncentrací bez nespecifického měření kontaminant. Pro měření je nutné vytvořit kontrolní standardní křivku. Přístroj lze používat samostatně po zaškolení.

Kit pro měření DNA, RNA a microRNA koncentrace k dispozici v CF: 1 reakce = 13 Kč.

Další informace

VIDEO 

GentleMACS™ Dissociator (MACS Miltenyi Biotec)

GentleMACS™ Dissociator (MACS Miltenyi Biotec)

gentleMACS™ Dissociator je přístroj pro automatickou disociaci tkání. 2 typy zkumavek jsou používány pro disociaci nebo homogenizaci tkání v uzavřeném systému. C-zkumavky jsou používány pro přípravu jednobuněčných suspenzí z tkání. M-zkumavky se používají pro homogenizaci tkání nebo buněk. Přístroj lze používat samostatně po zaškolení.

 

Zkumavky jsou k dispozici v CF:

  • Typ C pro disociaci tkáně na jednotlivé buňky. ZDARMA na vyzkoušení
  • Typ M pro kompletní disociaci tkáně. ZDARMA na vyzkoušení

 

Další informace

Video 

Gel Doc EZ system (Bio-Rad)

Gel Doc EZ system (Bio-Rad)

Gel Doc EZ System je velmi jednoduchý dokumentační systém pro gely nebo bloty, který vytvoří obrázky publikační kvality. Zahrnuje analyzační software, který obsahuje i auto image capture a auto analysis mode.

Rezervace zařízení není nutná.

 

  • UV tray: pro  ethidium bromid barvení DNA gelů a fluorescenční zobrazování
  • White tray: pro Coomassie, meděné, stříbrné a zinkové barvení
  • Blue tray: pro SYBR barvení – nyní není, pokud by byl zájem, dokoupíme
  • Stain-free tray: pro  stain-free zobrazování s Bio-Rad stain-free gely

 

Další informace

VIDEO 

Fragment Analyzer (Advanced Analytical Technologies)

Fragment Analyzer (Advanced Analytical Technologies)

Fragment Analyzer je automatická kapilární elektroforéza. Fragment Analyzer je doporučen firmou  Illumina™ jako automatický systém pro kvantifikaci a zjištění kvality pro gDNA, RNA a NGS. Tento přístroj lze zarezervovat pouze s operátorem.

Další informace

VIDEO 

Experion Automated Electrophoresis Station (Bio-Rad)

Experion Automated Electrophoresis Station (Bio-Rad)

Ke kontrole kvality nukleových kyselin slouží automatická elektroforetická stanice (Experion Automated Electrophoresis Station), která umožní nahrazení všech kroků klasické elektroforézy jako tvorba gelu, barvení, odbarvování, detekce bandů a zobrazení. Pro celou analýzu, která charakterizuje 11-12 vzorků do 30 minut je potřeba pouze 2 µl vzorku RNA nebo DNA. Součástí analýzy je i detailní report. Kvalitu RNA určí RQI (RNA Quality Indicator). RQI je číslo od 1 do 10, které je automaticky generováno pro celkovou lidskou RNA. RQI 1-4 je označení pro silně degradovanou RNA, RQI 4-7 pro akceptovatelnou kvalitu RNA a RQI 7-10 je označení pro dobrou kvalitu RNA.

Čipy pro analýzu RNA nebo DNA jsou k dispozici v CF, délka analýzy jednoho čipu je 30 min (nastavujte do kalendáře).

Přístroj lze používat samostatně po zaškolení.

 

Další informace

VIDEO 

CFX96 Real Time PCR Instrument (Bio-Rad)

CFX96 Real Time PCR Instrument (Bio-Rad)

Cyklér pro kvantitivní real-time PCR s gradientem  pro low profile 96 jamkové destičky.

 

Vlastosti CFX 96:

  • Zdroj světla: 6 LED
  • Detekce: 6 fotodiod
  • Excitační vlnová délka: 450–684 nm
  • Emisní vlnová délka: 515–730 nm
  • Gradientové rozmezí: 30–100°C, maximum gradient přes 24°C
  • Software pro genově expresní analýzy Precision melt software: Umožňuje High Resolution Melt analýzu, min. krok pro meltingovou křivku 0.2°C

 

Spotřební materiál, který není v ceně, lze zakoupit v CF:

1x 96 PCR destička s fólií 174 Kč bez DPH
1x strip (8 reakcí) + 1x víčko  33 Kč bez DPH


DALŠÍ INFORMACE
VIDEO 

epMotion P5073 Automated Pipetting System (Eppendorf)

epMotion P5073 Automated Pipetting System (Eppendorf)

epMotion 5073 pipetovací robot napipetuje za vás 384 jamkovou PCR destičku pro jakýkoliv přístroj a k tomu může vytvořit i bezchybnou ředící řadu. Volně programovatelný systém.

 

Výhody automatizace:

  • Opakovatelnost – automatický systém má stále stejnou variabilitu, není zatížen chybou operátora
  • Umožňuje efektivnější využití času
  • Sníží se cena plastického spotřebního materiálu
  • Robotický systém neztrácí koncentraci a nejde ho vyrušit

 

Speciální špičky jsou k dispozici v CF. 1 špička = 1,10 Kč. V

CF lze zakoupit i mastermixy pro qPCR.

DALŠÍ INFORMACE
VIDEO 

C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad)

C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad)

Termální cyklér od Bio-Radu využívá deep-well destičky, které jsou spolu s fólií k dispozici v CF.

 

Vlastnosti C1000:

  • Teploty gradientu: 30-100°C
  • Rozmezí gradientu: 1-24°C
  • Přesnost gradientu: ±0.2°C

 

PCR destičky a fólie jsou k dispozici v CF:

1 destička s 1 folií 172 Kč bez DPH
1 stip (8 reakcí) + 1 víčko 32 Kč bez DPH

K dispozici jsou i mastermixy.

Nanodrop 8000 (Thermo Scientific)

Nanodrop 8000 (Thermo Scientific)

Thermo Scientific NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometry dokáží měřit 1-8 mikroobjemů nukleových kyselin a proteinů najednou bez nutnosti ředění v objemu od 1 ul.

Thermo Scientific NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometry dokáží měřit 1-8 mikroobjemů nukleových kyselin a proteinů najednou.

 

Vlastnosti:

  • Možnost měřit 1-8 vzorků během jednoho cyklu v objemu 1µL na vzorek.
  • Široké spektrální rozmezí (220-750nm) umožňuje měření různých typů vzorků.
  • Patenotvaná metoda automaticky optimalizuje délku dráhy procházejícího světla a tím umožňuje měřit jak nízké, tak vysoké koncentrace a není potřeba vzorky ředit (2.5 to 3,700 ng/µL dsDNA)
  • Součástí jsou pre-konfigurované metody pro DNA, Protein A280, Microarray, Protein and Labels, Pierce 660, Bradford, BCA, and Lowry

 

Pokud si donesete špičky, můžete měřit zdarma. PCR produkty a plasmidy, prosím měřte v místnosti G1.049. Tiskárna je nastavena v chodbě, kde se nachází laboratoře BTU. Pokud chcete připojit další tiskárnu, kontaktujte Vlastu Korenkovou.

DALŠÍ INFORMACE

VIDEO 

BioMark qPCR System (Fluidigm)

BioMark qPCR System (Fluidigm)

Vysokokapacitní qPCR systém BioMark (Fluidigm) využívá integrované fluidní obvody známe jako dynamické nebo digitální araje. Přístroj umožňuje použít próby nebo EvaGreen mastermixy. Díky velké kapacitě čipu a malému objemu qPCR reakcí, výzkumníci ušetří reagencie, špičky, čas, množství primerů a prób a spotřebují velmi malé množství vzorků (stačí 2 ul).

 

Formáty čipů, které poskytujeme:

  • Flex Six™ IFC for Gene Expression: Čip pro 6 použití, který umožní zkombinovat 12 vzorků s 12 páry primerů (6x 144 reakcí)
  • 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression: kombinace 96 vzorků s 96 páry primerů (9216 reakcí)
  • 96.96 Dynamic Array IFC for Genotyping: kombinace 96 vzorků s 96 páry primerů (9216 reakcí)
  • 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression: kombinace 48 vzorků s 48 páry primerů (2304 reakcí)
  • 48.48 Dynamic Array IFC for Genotyping: ckombinace 48 vzorků s 48 páry primerů (2304 reakcí)
  • 12.765 Digital Array IFC: for dPCR s 12 vzorky
  • 48.770 Digital Array IFC: for dPCR se 48 vzorky

 

Světelný zdroj: Xenonová lampa s excitačními filtry

Detekce: CCD camera

Excitační vlnová délka: 465-505 nm, 510-550 nm

Emisní vlnová délka: 500-550 nm, 540-600 nm

Podpora pro: FAM-MGB,VIC-MGB,FAM-TAMRA, FAM-non fluorescent quencher, EvaGreen chemistry

 

Aplikace:

  • Genová exprese: validace mikroarají, single cell genová exprese
  • Digital PCR: Absolutní kvantifikace, detekce mutací
  • Genotypování: SNP assoční studie, Single cell genotypování

 

Čipy pro měření kvality RNA jsou k dispozici v CF.

 

DALŠÍ INFORMACE

Video: www.youtube.com/watch?v=PmbKDyHmJ7g&index=4&list=PL2F7AFE2B9F34DB47

www.youtube.com/watch?v=s9HUhuCbbhU

www.youtube.com/watch?v=UwzDc6wcGZg&index=3&list=PL2F7AFE2B9F34DB47

TissueLyser LT (Qiagen)

TissueLyser LT (Qiagen)

Pro disrupci tkání pro molekulární analýzu. Lze homogenizovat až 12 vzorků najednou v 2 ml zkumavkách. K dispozici je chlazený adapter a kovové homogenizační kuličky.

Před použitím se ujistěte jaké kuličky budou potřeba k dezintegraci vašeho typu vzorku. K dispozici v CF jsou kovové kuličky 5 mm v průměru (Cat No./ID 69989). Jedna kulička za 23 Kč.

Při rezervaci zadejte čas použití, minimum je 15 minut.

 

DALŠÍ INFORMACE

VIDEO1 

VIDEO2 

Publikace

2015

Pre-amplification in the context of high-throughput qPCR gene expression experiment. Korenková V, Scott J, Novosadová V, Jindřichová M, Langerová L, Švec D, Šídová M, Sjöback R. BMC Mol Biol. 2015 Mar 11;16:5. doi: 10.1186/s12867-015-0033-9.

Post-treatment recovery of suboptimal DNA repair capacity and gene expression levels in colorectal cancer patients. Slyskova J, Cordero F, Pardini B, Korenkova V, Vymetalkova V, Bielik L, Vodickova L, Pitule P, Liska V, Matejka VM, Levy M, Buchler T, Kubista M, Naccarati A, Vodicka P. Mol Carcinog. 2015 Sep;54(9):769-78. doi: 10.1002/mc.22141. Epub 2014 Mar 3

2014

SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. Malentacchi F, Pazzagli M, Simi L, Orlando C, Wyrich R, Günther K, Verderio P, Pizzamiglio S, Ciniselli CM, Zhang H, Korenková V, Rainen L, Bar T, Kubista M, Gelmini S. PLoS One. 2014 Nov 10;9(11):e112293. doi: 10.1371/journal.pone.0112293. eCollection 2014.

Biomarkers for monitoring pre-analytical quality variation of mRNA in blood samples. Zhang H, Korenková V, Sjöback R, Švec D, Björkman J, Kruhøffer M, Verderio P, Pizzamiglio S, Ciniselli CM, Wyrich R, Oelmueller U, Kubista M, Lindahl T, Lönneborg A, Rian E. PLoS One. 2014 Nov 4;9(11):e111644. doi: 10.1371/journal.pone.0111644. eCollection 2014.

Molecular characteristics of mismatch repair genes in sporadic colorectal tumors in Czech patients. Vymetalkova VP, Slyskova J, Korenkova V, Bielik L, Langerova L, Prochazka P, Rejhova A, Schwarzova L, Pardini B, Naccarati A, Vodicka P. BMC Med Genet. 2014 Jan 31;15:17. doi: 10.1186/1471-2350-15-17.

Effect of zearalenone on reproductive parameters and expression of selected testicular genes in mice. Zatecka E, Ded L, Elzeinova F, Kubatova A, Dorosh A, Margaryan H, Dostalova P, Korenkova V, Hoskova K, Peknicova J. Reprod Toxicol. 2014 Jun;45:20-30. doi: 10.1016/j.reprotox.2014.01.003. Epub 2014 Jan 9.

2013

Evaluation of tumor suppressor gene expressions and aberrant methylation in the colon of cancer-induced rats: a pilot study. Polakova Vymetalkova V, Vannucci L, Korenkova V, Prochazka P, Slyskova J, Vodickova L, Rusnakova V, Bielik L, Burocziova M, Rossmann P, Vodicka P. Mol Biol Rep. 2013 Oct;40(10):5921-9. doi: 10.1007/s11033-013-2699-8. Epub 2013 Sep 25.

Association of obesity susceptibility gene variants with metabolic syndrome and related traits in 1,443 Czech adolescents. Dušátková L, Zamrazilová H, Sedláčková B, Včelák J, Hlavatý P, Aldhoon Hainerová I, Korenková V, Bradnová O, Bendlová B, Kunešová M, Hainer V. Folia Biol (Praha). 2013;59(3):123-33.

Microfluidic high-throughput RT-qPCR measurements of the immune response of primary bovine mammary epithelial cells cultured from milk to mastitis pathogens. Sorg D, Danowski K, Korenkova V, Rusnakova V, Küffner R, Zimmer R, Meyer HH, Kliem H. Animal. 2013 May;7(5):799-805. doi: 10.1017/S1751731112002315. Epub 2012 Dec 11.

Tým

Ing. Lucie Langerová

Ing.
Lucie Langerová

Core facility manager

lucie.langerova@ibt.cas.cz
+420325873747
Mgr. David Švec, Ph.D.

Mgr.
David Švec, Ph.D.

david.svec@ibt.cas.cz
+420325873748