Zde se nacházíte: Biocev / Gene Core – Kvantitativní a digitální PCR

Gene Core – Kvantitativní a digitální PCR

O nás

BIOCEV – Gene Core je jedním z nejlépe vybavených poskytovatelů služeb v oblasti genové exprese ve střední Evropě. Máme bohaté zkušenosti s kontrolou kvality experimentu (RNA/DNA spike, ValidPrime, interplate kalibrátor, kvalita RNA/DNA), v single cell analýze (ALS Cellcelector), vysokokapacitní a digitální PCR (Fluidigm BioMark, BioRad QX200 Droplet digital PCR systém) i v přípravě NGS knihoven.

_MG_6990

Klademe důraz na kontrolu kvality, která je v experimentech často opomíjena. Efektivní kontrola kvality spočívá především ve využití molekulárních nástrojů pro kontrolu kontaminace, genomického pozadí i kvality RNA. Zabýváme se i vývojem těchto metod, které usnadňují a zpřesňují analýzu genové exprese a to až na úroveň jednotlivých buněk (ΔAmp).

_MG_7485

Kromě konvenčních analýz qPCR se zaměřujeme i na analýzu jednotlivých buněk a multianalytický přístup. Společně s profilováním genové exprese analýzou DNA/RNA/protein z jednoho vzorku a to až na úroveň jedné buňky tak nabízíme komplexní nástroj ke zmapování exprese ve vzorku pro charakterizaci typů buněk, stanovení stupně diferenciace i ke studiu jejich patologického stavu.

Nově zavádíme metody pro přípravu experimentálního designu RNA-Seq knihoven, kde efektivní protokol představuje prvotní předpoklad pro úspěšný projekt. A také novou ultra sensitivní techniku pro analýzu malých molekul RNA (microRNA). Základem nové metody, nazvané Two-tailed PCR je inovativní, patentově chráněná struktura DNA-oligonukleotidu sloužícího pro záchyt molekul microRNA. Díky svým dvou vazebným místům zaručuje mimořádnou kombinaci sensitivity a specificity

https://academic.oup.com/nar/article/3958703/Two-tailed-RT-qPCR-a-novel-method-for-highly

Klíčové výrazy

  • RNA a DNA
  • Izolace nukleových kyselin
  • Digitální PCR
  • Vysokokapacitní qPCR
  • Single Cell analýza
  • NGS
  • Absolutní kvantifikace
  • Relativní kvantifikace
  • Kontrola kvality

Tým a kontakt

_MG_7462
Místnost G1.047, G1.046
  • Mgr. David Švec, Ph.D.

  • Postdoc a konzultant pro analýzy jednotlivých buněk
  • +420 325 873 748
Místnost
G1.048

Kde nás najdete v BIOCEV centru

Mapa1NP-PCR


Vybavení


  • The AVISO CellCelector (Automated Lab Solutions)

    fbcb50ccc1 Advalytix3Aviso_CellColector

    Umožňujeme využití přístroje CellCelector, který slouží pro automatickou detekci, citlivou izolaci a přesný přenos jednotlivých buněk, buněčných kolonií nebo částí tkáně. Tento přístroj lze zarezervovat pouze s operátorem. Nutno zamluvit 48 hodin předem.

    další informace

    video: www.youtube.com/watch?v=PEMR2XxMXdA

     

  • 2100 Bioanalyzer (Agilent)

    Agilent je automatická mikrofluidní platforma, která umožní nahrazení všech kroků klasické elektroforézy jako tvorba gelu, barvení, odbarvování, detekce bandů a zobrazení. Pro celou analýzu, která charakterizuje 11-12 vzorků do 40 minut je potřeba pouze 1.5- 2 µl vzorku RNA nebo DNA. Součástí analýzy je i detailní report. Kvalitu RNA určí RIN (RNA Integrity Number). RIN je číslo od 1 do 10, je numerické označení pro integritu RNA.

    Čipy pro měření kvality RNA jsou k dispozici v CF.

    Další informace

    Video: www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106

    www.youtube.com/watch?v=Bu4bGb85SGI

  • LightCycler 480 System (Roche)

    Cyklér pro kvantitivní real-time PCR od firmy Roche. 96  a 384 jamkové destičky Roche jsou k dispozici v CF. Přístroj lze používat samostatně po zaškolení. V CF lze zakoupit mastermixy pro RT-qPCR.Službu lze zkombinovat s automatickým napipetování 384 jamkové destičky přístrojem Epmotion P5073 (Eppendorf).

    Vlastnosti LC480:

    Zdroj světla: Xenonová lampa
    Detekce: CCD kamera
    Excitační filtry: 440 nm, 465 nm, 498 nm, 533 nm, 618 nm
    Emisní filtry: 488 nm, 510 nm, 580 nm, 610 nm, 640 nm, 660 nm
    Stříbrný termální blok
    LightCycler 480 Software poskytuje víceúčelové řešení pro většinu bězných real-time PCR aplikací
    High Resolution Melting Analysis

    V CF můžete zakoupit:

    1x destička 384 + folie: 221 bez DPH
    1x destička 96 + folie: 120 bez DPH

    Další informace

    Video: www.youtube.com/watch?v=FwPzrFN9eV4

  • QX200 droplet digital PCR system (Bio-Rad)

    Digitální PCR systém poskytuje absolutní počty DNA nebo cDNA molekul bez nutnosti vytvoření standardní křivky. Systém funguje pro všechny PCR aplikace s mastermixem EvaGreen nebo mastermixem pro próby. Materiál k dispozici v CF. Přístroj lze používat samostatně po zaškolení.

    Veškerý materiál pro ddPCR je k zakoupení v CF.

    Nutno rezervovat C1000 před ddPCR na 2 hodiny.

    Nabízíme kvantifikaci s EvaGreenem, s probama a kvantifikaci NGS knihoven.

    Pro různý počet vzorků se cena různí: 8, 16, 48, 24.

    Další informace

    Video: www.youtube.com/watch?v=Qwma-1Ek-Y4

  • Qubit® 2.0 Fluorometer (life Technologies)

    The Qubit® 2.0 Fluorometr umožňuje přesnou kvantifikaci DNA, RNA a proteinů s využitím specifického fluorescenčního značení. Umožňuje kvantifikace velmi nízkých koncentrací bez nespecifického měření kontaminant. Pro měření je nutné vytvořit kontrolní standardní křivku. Přístroj lze používat samostatně po zaškolení.

    Kit pro měření DNA, RNA a microRNA koncentrace k dispozici v CF: 1 reakce = 13 Kč.

    Další informace

    Video: www.youtube.com/watch?v=RRKZN–7jqg

     

  • QIAcube (Qiagen)

    QIAcube pracuje s QIAGEN kity a kolonkami a zcela automaticky purifikuje Vaše vzorky. Všechny kroky jsou zcela automatizovány a systém zpracuje 12 vzorků během 1 cyklu. Špičky pro přístroj jsou k dispozici. Přístroj lze používat samostatně po zaškolení.

    Další informace

    Video: www.qiagen.com/media/product-tools/flash/qiacube/360/index.html

    Video 2

  • GentleMACS™ Dissociator (MACS Miltenyi Biotec)

    gentleMACS™ Dissociator je přístroj pro automatickou disociaci tkání. 2 typy zkumavek jsou používány pro disociaci nebo homogenizaci tkání v uzavřeném systému. C-zkumavky jsou používány pro přípravu jednobuněčných suspenzí z tkání. M-zkumavky se používají pro homogenizaci tkání nebo buněk. Přístroj lze používat samostatně po zaškolení.

    Zkumavky jsou k dispozici v CF:
    Typ C pro disociaci tkáně na jednotlivé buňky. ZDARMA na vyzkoušení
    Typ M pro kompletní disociaci tkáně. ZDARMA na vyzkoušení
    Další informace
    Video: www.youtube.com/watch?v=vfAdmYCiaQE

  • Gel Doc EZ system (Bio-Rad)

    Gel Doc EZ System je velmi jednoduchý dokumentační systém pro gely nebo bloty, který vytvoří obrázky publikační kvality. Zahrnuje analyzační software, který obsahuje i auto image capture a auto analysis mode.

    Rezervace zařízení není nutná.

    UV tray: pro  ethidium bromid barvení DNA gelů a fluorescenční zobrazování
    White tray: pro Coomassie, meděné, stříbrné a zinkové barvení
    Blue tray: pro SYBR barvení – nyní není, pokud by byl zájem, dokoupíme
    Stain-free tray: pro  stain-free zobrazování s Bio-Rad stain-free gely

    Další informace

    Video:  https://www.youtube.com/watch?v=JiV51QfrvPU

     

  • Fragment Analyzer (Advanced Analytical Technologies)

    Fragment Analyzer je automatická kapilární elektroforéza. Fragment Analyzer je doporučen firmou  Illumina™ jako automatický systém pro kvantifikaci a zjištění kvality pro gDNA, RNA a NGS. Tento přístroj lze zarezervovat pouze s operátorem.

    Další informace

    Video: http://aati-us.com/product/fragment-analyzer

  • Experion Automated Electrophoresis Station (Bio-Rad)

    Ke kontrole kvality nukleových kyselin slouží automatická elektroforetická stanice (Experion Automated Electrophoresis Station), která umožní nahrazení všech kroků klasické elektroforézy jako tvorba gelu, barvení, odbarvování, detekce bandů a zobrazení. Pro celou analýzu, která charakterizuje 11-12 vzorků do 30 minut je potřeba pouze 2 µl vzorku RNA nebo DNA. Součástí analýzy je i detailní report. Kvalitu RNA určí RQI (RNA Quality Indicator). RQI je číslo od 1 do 10, které je automaticky generováno pro celkovou lidskou RNA. RQI 1-4 je označení pro silně degradovanou RNA, RQI 4-7 pro akceptovatelnou kvalitu RNA a RQI 7-10 je označení pro dobrou kvalitu RNA.

    Čipy pro analýzu RNA nebo DNA jsou k dispozici v CF, délka analýzy jednoho čipu je 30 min (nastavujte do kalendáře).

    Přístroj lze používat samostatně po zaškolení.
    Další informace

    Video: www.youtube.com/watch?v=2VCAZFkhxO8

  • CFX96 Real Time PCR Instrument (Bio-Rad)

    Cyklér pro kvantitivní real-time PCR s gradientem  pro low profile 96 jamkové destičky.

     

    Vlastosti CFX 96

    Zdroj světla: 6 LED
    Detekce: 6 fotodiod
    Excitační vlnová délka: 450–684 nm
    Emisní vlnová délka: 515–730 nm
    Gradientové rozmezí: 30–100°C, maximum gradient přes 24°C
    Software pro genově expresní analýzy Precision melt software: Umožňuje High Resolution Melt analýzu, min. krok pro meltingovou křivku 0.2°C
    Spotřební materiál, který není v ceně, lze zakoupit v CF:

    1x 96 PCR destička s fólií 174 Kč bez DPH
    1x strip (8 reakcí) + 1x víčko 33 Kč bez DPH

    Další informace
    Video: www.youtube.com/watch?v=NY9mj-qILDU

  • epMotion P5073 Automated Pipetting System (Eppendorf)

    epMotion 5073 pipetovací robot napipetuje za vás 384 jamkovou PCR destičku pro jakýkoliv přístroj a k tomu může vytvořit i bezchybnou ředící řadu. Volně programovatelný systém.

    Výhody automatizace:
    o    Opakovatelnost – automatický systém má stále stejnou variabilitu, není zatížen chybou operátora
    o    Umožňuje efektivnější využití času
    o    Sníží se cena plastického spotřebního materiálu
    o    Robotický systém neztrácí koncentraci a nejde ho vyrušit

     

    Speciální špičky jsou k dispozici v CF. 1 špička = 1,10 Kč. V

    CF lze zakoupit i mastermixy pro qPCR.

    Další informace
    Video: www.youtube.com/watch?v=REVXumkaYrg www.youtube.com/watch?v=vgJdySaNPXY

  • C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad)

    Termální cyklér od Bio-Radu využívá deep-well destičky, které jsou spolu s fólií k dispozici v CF.

     

    Vlastnosti C1000:

    Teploty gradientu: 30-100°C
    Rozmezí gradientu: 1-24°C
    Přesnost gradientu: ±0.2°C
    PCR destičky a fólie jsou k dispozici v CF:

    1 destička s 1 foli 172 Kč bez DPH
    1 stip (8 reakcí) + 1 víčko 32 Kč bez DPH

    K dispozici jsou i mastermixy.

  • Nanodrop 8000 (Thermo Scientific)

    Thermo Scientific NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometry dokáží měřit 1-8 mikroobjemů nukleových kyselin a proteinů najednou bez nutnosti ředění v objemu od 1 ul.

    Thermo Scientific NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometry dokáží měřit 1-8 mikroobjemů nukleových kyselin a proteinů najednou.

     

    Vlastnosti:

    Možnost měřit 1-8 vzorků během jednoho cyklu v objemu 1µL na vzorek.
    Široké spektrální rozmezí (220-750nm) umožňuje měření různých typů vzorků.
    Patenotvaná metoda automaticky optimalizuje délku dráhy procházejícího světla a tím umožňuje měřit jak nízké, tak vysoké koncentrace a není potřeba vzorky ředit (2.5 to 3,700 ng/µL dsDNA)
    Součástí jsou pre-konfigurované metody pro DNA, Protein A280, Microarray, Protein and Labels, Pierce 660, Bradford, BCA, and Lowry

     

    Pokud si donesete špičky, můžete měřit zdarma. PCR produkty a plasmidy, prosím měřte v místnosti G1.049.Tiskárna je nastavena v chodbě, kde se nachází laboratoře BTU. Pokud chcete připojit další tiskárnu, kontaktujte Vlastu Korenkovou.

    Další informace

    Video: www.youtube.com/watch?v=WfirigiekwM

  • BioMark qPCR System (Fluidigm)

    Vysokokapacitní qPCR systém BioMark (Fluidigm) využívá integrované fluidní obvody známe jako dynamické nebo digitální araje. Přístroj umožňuje použít próby nebo EvaGreen mastermixy. Díky velké kapacitě čipu a malému objemu qPCR reakcí, výzkumníci ušetří reagencie, špičky, čas, množství primerů a prób a spotřebují velmi malé množství vzorků (stačí 2 ul).

     

    Formáty čipů, které poskytujeme:

    Flex Six™ IFC for Gene Expression: Čip pro 6 použití, který umožní zkombinovat 12 vzorků s 12 páry primerů (6x 144 reakcí)
    96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression: kombinace 96 vzorků s 96 páry primerů (9216 reakcí)
    96.96 Dynamic Array IFC for Genotyping: kombinace 96 vzorků s 96 páry primerů (9216 reakcí)
    48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression: kombinace 48 vzorků s 48 páry primerů (2304 reakcí)
    48.48 Dynamic Array IFC for Genotyping: ckombinace 48 vzorků s 48 páry primerů (2304 reakcí)
    12.765 Digital Array IFC: for dPCR s 12 vzorky
    48.770 Digital Array IFC: for dPCR se 48 vzorky

     

    Světelný zdroj: Xenonová lampa s excitačními filtry
    Detekce: CCD camera
    Excitační vlnová délka: 465-505 nm, 510-550 nm
    Emisní vlnová délka: 500-550 nm, 540-600 nm
    Podpora pro: FAM-MGB,VIC-MGB,FAM-TAMRA, FAM-non fluorescent quencher, EvaGreen chemistry

    Aplikace:

    Genová exprese: validace mikroarají, single cell genová exprese
    Digital PCR: Absolutní kvantifikace, detekce mutací
    Genotypování: SNP assoční studie, Single cell genotypování

    Čipy pro měření kvality RNA jsou k dispozici v CF.

    Další informace

    Video: www.youtube.com/watch?v=PmbKDyHmJ7g&index=4&list=PL2F7AFE2B9F34DB47

    www.youtube.com/watch?v=s9HUhuCbbhU

    www.youtube.com/watch?v=UwzDc6wcGZg&index=3&list=PL2F7AFE2B9F34DB47

  • TissueLyser LT (Qiagen)

    Pro disrupci tkání pro molekulární analýzu. Lze homogenizovat až 12 vzorků najednou v 2 ml zkumavkách. K dispozici je chlazený adapter a kovové homogenizační kuličky.

    Před použitím se ujistěte jaké kuličky budou potřeba k dezintegraci vašeho typu vzorku. K dispozici v CF jsou kovové kuličky 5 mm v průměru (Cat No./ID   69989). Jedna kulička za 23 Kč.

    Při rezervaci zadejte čas použití, minimum je 15 minut.

    Další informace

    Video: www.qiagen.com/media/product-tools/flash/TissueLyserLT/360/index.html

    https://www.youtube.com/watch?v=31O6AKamfks

Naše služby

Experimentální design
Izolace jednotlivých buněk
Izolace nukleových kyselin
Kontrola kvality a kvantity nukleových kyselin

  • Kontrola kvantity nukleových kyselin spektrofotometrem Nanodrop 8000 (Thermo Scientific)
  • Kontrola kvantity nukleových kyselin fluorospektorfotometrem Quibit 2.0 (Life Technologies)
  • Kontrola kvality nukleových kyselin Experion Automated Electrophoresis Station (Bio-Rad)
  • Kontrola kvality nukleových kyselin Bioanalyzérem 2100 (Agilent)
  • Kontrola kvality nukleových kyselin Fragment analyzérem (Advanced Analytical)
Reverzní transkripce
Kvantitativní real-time PCR

  • Absolutní kvantifikace
  • Relativní kvantifikace
  • Výběr vhodných referenčních genů
  • Kontrola kontaminace genomovou DNA
  • Validace nových primerů a prób
  • Kontrola inhibice v RT nebo v qPCR
Vysokokapacitní qPCR: BioMark (Fluidigm)

  • Genová exprese: 9216 qPCR reakcí s GE 96.96 nebo 2304 qPCR reakcí s GE 48.48
  • Genotypování: 9216 qPCR reakcí s GE 96.96 nebo 2304 qPCR reakcí s GE 48.48
  • Preamplifikace
Digitální PCR

  • Droplet digitální PCR s QX200 (Bio-Rad) 8 – 96 vzorků
  • Mikrofluidní digitální PCR s BioMark (Fluidigm) pro 12 nebo 48 vzorků
Speciální aplikace:

  • Single cell qPCR analýza
  • Příprava knihoven pro NGS (RNA-Seq)
  • Two-Tailed miRNA assays
Automatizace

  • Automatická izolace nukleových kyselin s QiaCube (Qiagen) pro 12 vzorků
  • Automatické pipetování a příprava ředících řad s epMotion P5073 (Eppendorf)

Podrobný rozpis služeb

Biostatistické služby a experimentální design

1

Správný experimentální design je kritický pro konečné experimentální výstupy. Vypočítáme Vám minimální množství vzorků, které jsou potřeba pro detekci specifického rozdílu. Zkonzultujeme kompletní postup se všemi experimentálními kroky, poradíme jak odebírat vzorky, jak je uchovávat a transportovat, jaké metody využít, jaké kontroly používat a nabídneme i zpracování změřených dat a statistické vyhodnocení.
Ke zpracování qPCR dat používáme software GenEx Enterprise (MultiD Analyses), který u nás můžete zakoupit nebo SAS.
Náš zkušený biostatistik s Vámi zkonzultuje Váš projekt a navrhne nejlepší strategii nebo zcela kompletní návrh experimentálního designu. Biostatistika lze zamluvit zdarma po půl hodinách ve středu v rozmezí od 13.00 do 16.00. Delší analýzu lze vytvořit po osobní domluvě podle platného ceníku.

Izolace jednotlivých buněk

  1. Umožňujeme využití přístroje CellCelector s obsluhou, který slouží pro automatickou detekci, citlivou izolaci a přesný přenos jednotlivých buněk, buněčných kolonií nebo částí tkáně.
    fbcb50ccc1
  2. Nabízíme také izolaci jednotlivých buněk z tkání pomocí přístroje gentleMACS™ Dissociator, který slouží pro automatickou disociaci tkání. 2 typy zkumavek jsou používány pro disociaci nebo homogenizaci tkání v uzavřeném systému. C-zkumavky jsou používány pro přípravu jednobuněčných suspenzí z tkání. M-zkumavky se používají pro kompletní homogenizaci tkání nebo buněk. Paralelně se mohou připravovat 2 vzorky.Zkumavky jsou k dispozici v CF:Typ C pro disociaci tkáně na jednotlivé buňky. ZDARMA na vyzkoušení.
    Typ M pro kompletní disociaci tkáně. ZDARMA na vyzkoušení.

 

GentleMACS™ Dissociator (MACS Miltenyi Biotec)

Kontrola kvality a kvantity nukleových kyselin

Z Vašich vzorků vyizolujeme DNA, RNA, mikroRNA pro jakoukoliv následující aplikaci. K dispozici je automatická izolace pomocí Qiacube (Qiagen) nebo manuální izolace naším zkušeným personálem.

QIAcube (Qiagen)

Izolace z následujících typů vzorků:

  • Krev, plazma, další biologické tekutiny
  • Klinické FFPE vzorky a zamražená čerstvá tkáň
  • Buněčné linie
  • Specifický vzorek dle zákazníka, např. hmyz, rostlinná tkáň…

Součástí izolace je měření kvantity nukleových kyselin
DOPORUČUJEME zjistit kvalitu (integritu) nukleových kyselin

Kontrola kvality a kvantity nukleových kyselin

Kontrola kvantity nukleových kyselin spektrofotometrem Nanodrop 8000 (Thermo Scientific)

Nabízíme měření vzorků s použitím Nanodrop 8000 v rozmezí range (220 – 750nm), který vyžaduje 1-2 µL vzorku, který se nemusí ředit. Spolehlivá koncentrace od 2,5 do 3,700 ng/µL dsDNA. Lze změřit 96 vzorků v 6 minutách:

  • DNA a RNA (260nm)
  • Purifikovaný protein (280nm)
  • Zlaté nanopartikule (520nm)
  • Pre-konfigurované metody pro DNA, Protein A280, Microarray, Protein and Labels, Pierce 660, Bradford, BCA, Lowry OD měření (600 nm)Nanodrop 8000 (Thermo Scientific)

Kontrola kvantity nukleových kyselin fluorospektorfotometrem Quibit 2.0 (Life Technologies)

The Qubit® 2.0 Fluorometer umožňuje přesnou kvantifikaci DNA, RNA a proteinů s využitím specifického fluorescenčního značení. Umožňuje kvantifikace velmi nízkých koncentrací bez nespecifického měření kontaminant. Pro měření je nutné vytvořit kontrolní standardní křivku. Detekční limit pro RNA je 5 ng a DNA je 0.2 ng a mikroRNA je 1 ng, pro protein je 1 ng.

Další informace na Qubit® Assays

Qubit® 2.0 Fluorometer (Life Technologies)2

Kontrola kvality nukleových kyselin Experion Automated Electrophoresis Station (Bio-Rad)

Ke kontrole kvality nukleových kyselin slouží automatická elektroforetická stanice (Experion Automated Electrophoresis Station), která umožní nahrazení všech kroků klasické elektroforézy jako tvorba gelu, barvení, odbarvování, detekce bandů a zobrazení. Pro celou analýzu, která charakterizuje 11-12 vzorků do 30 minut je potřeba pouze 2 µl vzorku RNA nebo DNA.
Součástí analýzy je i detailní report. Kvalitu RNA určí RQI (RNA Quality Indicator). RQI je číslo od 1 do 10, které je automaticky generováno pro celkovou lidskou RNA. RQI 1-4 je označení pro silně degradovanou RNA, RQI 4-7 pro akceptovatelnou kvalitu RNA a RQI 7-10 je označení pro dobrou kvalitu RNA.

3

Kontrola kvality nukleových kyselin Bioanalyzérem 2100 (Agilent)

Ke kontrole kvality nukleových kyselin slouží automatická mikrofluidní platforma Agilent 2100 BioAnalyzer, která umožní nahrazení všech kroků klasické elektroforézy jako tvorba gelu, barvení, odbarvování, detekce bandů a zobrazení.
Pro celou analýzu, která charakterizuje 11-12 vzorků do 40 minut je potřeba pouze 2 µl vzorku RNA nebo DNA.
Součástí analýzy je i detailní report. Kvalitu RNA určí RIN (RNA Integrity Number). RIN je číslo od 1 do 10, které je automaticky generováno pro celkovou lidskou RNA, je to numerické označení pro integritu RNA. RIN 1-4 je označení pro silně degradovanou RNA, RIN 4-7 pro akceptovatelnou kvalitu RNA a RIN 7-10 je označení pro dobrou kvalitu RNA.

agilent
4

Kontrola kvality nukleových kyselin Fragment analyzérem (Advanced Analytical)

Fragment Analyzer (Advanced Analytical) je automatická kapilární elektroforéza. Fragment Analyzer je doporučen firmou Illumina™ jako automatický systém pro kvantifikaci a zjištění kvality pro gDNA, RNA a NGS.

  • pro 12-96 vzorků
  • Rozliší fragmenty od 10 bp do 40,000 bp
  • Rozliší až 2 bp na fragment
  • Detekce začíná na 5 pg/μL

Různé kity jsou k dispozici v qPCR a dPCR CF.

Fragment Analyzer (Advanced Analytical Technologies)

Reverzní transkripce

Pro následnou RT-PCR analýzu přepíšeme kvalitně vyizolovanou RNA na cDNA. Pro přepis upřednostňujeme použití TATAA Grandscript cDNA SuperMix v přístroji C1000 (Bio-Rad).

5

Kvantitativní real-time PCR

Absolutní kvantifikace

Při absolutní kvantifikaci se používá standardní křivka se standardy o známé koncentraci. Koncentrace je vyjádřena v počtu kopií. Vzorky o neznámé koncentraci jsou porovnány se standardy o známé koncentraci a koncentrace je intrapolována ze standardní křivky.

POZOR: Pokud je standardní křivka nepřesná nebo vytvořena z nevhodných standardů, pak i počty kopií získané ze standardní křivky jsou nespolehlivé. Při nemožnosti vytvořit vhodný standard, je výhodné použít jiné metody, digitální PCR.

PŘÍKLAD: qPCR KAPA Library Quantification Kit pro kvantifikaci NGS knihoven

6
7
8

Relativní kvantifikace

Pomocí relativní kvantifikace analyzujeme změny genové exprese v určitém vzorku (např. čas 48 hodin) v porovnání s referenčním vzorkem (např. čas 0 nebo zdravá kontrola, atd.). Všechny vzorky jsou většinou normalizovány k referenčním genům (viz. referenční geny). Normalizovaná kontrola s normalizovaným vzorkem je porovnána a výsledkem je násobek exprese (fold change), např. exprese genu X ve vzorku ovlivněným léčivem je 5x nižší než expese genu X v kontrolního vzorku, který nebyl ovlivněn.

9

Výběr vhodných referenčních genů

Cílem genově expresních studií je zjistit zda exprese genu, který vás zajímá, stoupá nebo klesá. Proto cílový gen musíme relativně vztáhnout ke stabilně se exprimujícímu genu (referenčnímu genu či genům), který pak může sloužit jako základna. Takový gen by měl být stabilní za všech podmínek VAŠEHO experimentu. A pro tento účel musí být také validován pro každý nový, specifický experiment. Neexistuje žádný univerzální referenční gen.
Referenční geny jsou endogenní kontrolou, a proto mohou „opravit“ i nestejné množství RNA, které přidáte do reverzní transkripce. Pokud je referenční gen v duplexu s cílovým genem (v jedné reakci), může „opravit“ i pipetovací chyby v qPCR.
Stabilitu potencionálních referenčních genů lze otestovat na panelu referečních genů s minimálně deseti reprezentativními vzorky pro každou experimentální podmínku, softwarem NormFinder. Nabízíme testování vhodných referenčních genů s pomocí referenčních panelů pro lidské nebo myší vzorky obsahující 12 potencionálních referenčních genů.

10
11

Kontrola kontaminace genomovou DNA

Při izolaci RNA je téměř nemožné vyizolovat čistou RNA bez jakékoliv kontaminace genomovou DNA. Po reverzní transkripci není možné rozeznat kontaminující genomovou DNA od cDNA, což vede ke generování falešně pozitivních výsledků a špatné kvantifikaci RNA.

Jakými způsoby se lze zbavit genomové DNA:

  • DNasováním po či při izolaci
  • RT- kontrola pro každý vzorek a následný odpočet genomové DNA (software GenEx)
  • ValidPrime kontrola a následný odpočet genomové DNA (software GenEx)
  • Navržení primerů přes hranice intronu (nemusíme se zbavit pseudogenů)

Obr. Příklad špatné kvantifikace RNA kontaminované gDNA

12

Zkontrolujeme kvalitu vašeho preparátu s pomocí valid primu.

Validace nových primerů a prób

Po zakoupení primerů či prób od jakékoliv společnosti zabývající se primer designem nemusíte dostat všechny informace, které jsou nutné pro submitování publikace do vědeckého časopisu.

Nabízíme kompletní prověření Vašich primerů a prób pro qPCR nebo dPCR podle MIQE pravidel:

  • Specificita: pomocí elektroforetického gelu a meltingového profilu
  • Optimizace annelingové teploty primerů a prób
  • Změření efektivity primerů a zjistění dynamického rozsahu reakce (s pomocí carrieru)
  • Na vyžádání změření limitu kvantifikace či detekce
  • Zahrnutí všech kontrol: NTC, valid prime či RT-, kalibrační kontroly, pozitivní či negativní kontrola
  • Validace multiplexové reakce

Obr. Příklad sériového ředění pro zjištění efektivity primerů

13
14

Kontrola inhibice v RT nebo v qPCR

Inhibice v reverzní transkripci a během qPCR reakce způsobují chybné biologické výstupy. Inhibitory v reakci způsobí částečné zpomalení reakce až její úplné zastavení. Inhibice v reakci se nedá nijak odpočítat či přepočítat, lze ji pouze detekovat. Vzorek, který je inhibovaný by se měl dostatečně naředit, pokud to koncentrace vzorku dovolí. Pokud je vzorek inhibován a jeho koncentrace je nízká, jediným řešením je nová izolace nukleových kyselin.

Inhibitory v reakci mohou pocházet:

  • Ze vzorku (tkáňově nebo vzorkově specifická inhibice), například hemoglobin v krvi
  • Z fixativa, ve kterém se tkáň uchovává, například FFPE
  • Z použité izolační metody, například trizol nebo chemikálie použité pro uchovávání nukleových kyselin jako EDTA, glykogen
  • Z reverzní transkripce. Inhibiční je vysoká koncentrace RT enzymu nebo Taq DNA polymerázy, která se vnese do reakce s vyšším objemem RNA
  • Z interakce specifického qPCR templátu se specifickou próbou nebo primerem. Například při příliš velké koncentraci próby v reakci

Pomůžeme Vám zkontrolovat inhibici sériovým ředěním či spikem. A navrhneme spolehlivé ředění pro RT nebo qPCR reakci.

Obr. Příklad TATAA RNA spiku: A. Žádná inhibice. B. Inhibice v RT. C. Inhibice v qPCR. D. Inhibice v RT i qPCR.

15
16

Vysokokapacitní qPCR: BioMark (Fluidigm)

Genová exprese: 9216 qPCR reakcí s GE 96.96 nebo 2304 qPCR reakcí s GE 48.48

Vysokokapacitní zařízení BioMark (výrobce Fluidigm) umožňuje současnou analýzu exprese až 96 genů v 96 vzorcích (9216 reakcí) v rámci jediného experimentu. Měření probíhá pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR), která je jednou z nejcitlivějších metod pro kvantifikaci mRNA či microRNA. Možnost analyzovat větší množství genů najednou vybízí k použití multivariantních statistických analýz. Lze použít s próbami nebo EvaGreenem.
Využitím vysokokapacitního qPCR ušetříte:

  • Čas – celý experiment za 1 den
  • Materiál – stačí 2 ul vzorku pro analýzu s 96 geny
  • Mastermix – místo 46 ml vám stačí 240 ul
  • Primery a proby – místo 4.6 ml pro všechny páry stačí 240 ul (2.5 ul pro 1 pár)
  • Špičky – místo 18432 pipetovacích kroků vám jich stačí 196
  • Destičky – místo 24 destiček (384 jamkových) vám stačí 1 Biomark array
  • Interprate kalibraci – změření se zpřesní tím, že nepotřebujete použít interplate kalibraci, když se vám celý experiment vejde na 1 BioMark array
  • Práci – celý experiment uděláme za vás
  • Peníze – celý experiment vyjde levněji než kdybyste ho prováděli na 384 jamkových PCR destičkách

17

Fluidigm GE čipy, které jsou k dispozici:

  • GE 96.96: pro 96 vzorků a 96 primerů, dohromady 9216 qPCR reakcí
  • GE 48.48: pro 48 vzorků a 48 primerů, dohromady 2304 qPCR reakcí
  • Flexi six IFC: pro 6 použití, pro každý run kombinace 12 vzorků a 12 primerů, dohromady 144 qPCR reakcí

18

Genotypování: 9216 qPCR reakcí s GE 96.96 nebo 2304 qPCR reakcí s GE 48.48

Vysokokapacitní zařízení BioMark (Fluidigm) umožňuje současnou analýzu exprese až 96 genů v 96 vzorcích (9216 reakcí) v rámci jediného experimentu. Měření probíhá pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR).

Využitím vysokokapacitního qPCR ušetříte:

  • Čas – celý experiment za 1 den
  • Materiál – stačí 2 ul vzorku pro analýzu s 96 geny, pokud je DNA dostatečně koncentrované, není nutno preamplifikovat
  • Mastermix – místo 46 ml vám stačí 240 ul
  • Primery a proby – místo 4.6 ml pro všechny páry stačí 240 ul (2.5 ul pro 1 pár)
  • Špičky – místo 18432 pipetovacích kroků vám jich stačí 196
  • Destičky – místo 24 destiček (384 jamkových) vám stačí 1 Biomark array
  • Interprate kalibraci – změření se zpřesní tím, že nepotřebujete použít interplate kalibraci, když se vám celý experiment vejde na 1 BioMark array
  • Práci – celý experiment uděláme za vás
  • Peníze – celý experiment vyjde levněji než kdybyste ho prováděli na 384 jamkových PCR destičkách

19

Fluidigm GT čipy, které jsou k dispozici:

  • GT 96.96: pro 96 vzorků a 96 primerů, dohromady 9216 qPCR reakcí
  • GT 48.48: pro 48 vzorků a 48 primerů, dohromady 2304 qPCR reakcí
  • Flexi six IFC: pro 6 použití, pro každý run kombinace 12 vzorků a 12 primerů, dohromady 144 qPCR reakcí

20

Preamplifikace

Preamplifikace je specifické, exponenciální, zmnožení templátu, který se používá u málo koncentrovaných vzorků (STA preamplifikace). Preamplifikace vzorků je nezbytná pro měření genové exprese s využitím vysokokapacitních arají BioMark systému (Fluidigm). Tento systém potřebuje vysoké koncentrace vstupního templátu (cDNA), které se nedají dosáhnout reverzní transkripcí.

Nabízíme preamplifikování Vašich vzorků pomocí multiplexní PCR využívající souhrn všech Vašich specifických primerů s limitovaným počtem PCR cyklů. Provádíme také validaci preamplifikace, viz obr.

Obr. Validace preamplifikace podle Rusnakove: PloS One 8(8), e69734 (2013).

21

Digitální PCR

Droplet digitální PCR s QX200 (Bio-Rad) 8 – 96 vzorků

Digitální PCR systém poskytuje absolutní počty DNA nebo cDNA molekul bez nutnosti vytvoření standardní křivky. Systém funguje pro všechny PCR aplikace s mastermixem EvaGreen nebo mastermixem pro proby. K dispozici jsou dva kanály FAM a VIC.

Princip droplet digitálního PCR:

  1. Rozdělení kopií ze vzorku do jednotlivých kapiček, kterých se může vytvořit až 20 000
  2. Amplifikace pomocí PCR a specifických primerů
  3. Systém spočítá počet pozitivních kapek a negativních kapek (systém 1 a 0), software přepočítá skutečnost, že v jedné kapce se může nacházet více kopií než 1

22

Aplikace ddPCR:

  • Absolutní kvantifikace
  • CNV (Copy number variation)
  • NGS validace a kvantifikace knihoven
  • Genová exprese
  • EvaGreen aplikace

23

Veškerý materiál pro ddPCR je k zakoupení v CF.

Mikrofluidní digitální PCR s BioMark (Fluidigm) pro 12 nebo 48 vzorků

Digitální qPCR systém B ioMark (Fluidigm) poskytuje absolutní počty DNA nebo cDNA molekul bez nutnosti vytvoření standardní křivky. Systém funguje pro všechny PCR aplikace s mastermixem EvaGreen nebo mastermixem pro proby. K dispozici jsou dva kanály FAM a VIC. Lze sledovat real-time průběh reakce a lze vyřadit nekvalitní křivky (pokus se vyskytnou) a nastavit threshold.

BioMark qPCR System (Fluidigm)

Princip mikrofluidního digitálního PCR:

  1. Rozdělení kopií ze vzorku do jednotlivých kompartmentů (1 vzorek do 770 kompartmentů)
  2. Amplifikace pomocí qPCR a specifických primerů
  3. Systém spočítá počet pozitivních kompartmentů a negativních komparmentů (systém 1 a 0), software přepočítá skutečnost, že v jedné kapce se může nacházet více kopií než 1
  4. Při analýze lze stejné vzorky poolovat dohromady

24

Aplikace dPCR:

  • Absolutní kvantifikace
  • CNV (Copy number variation)
  • Genová exprese
  • EvaGreen aplikace

25

Veškerý materiál pro ddPCR je k zakoupení v CF.

Speciální aplikace: Single cell qPCR analýza

Analýza jednotlivých buněk s přístrojem Fluidigm: genová exprese

26

Analýza jednotlivých buněk pomocí digitálního PCR (QX200)

27

Automatizace

Automatická izolace nukleových kyselin s QiaCube (Qiagen) pro 12 vzorků

Přístroj pro izolaci nukleových kyselin QiaCube, pipetovací robot EpMotion 5073 a vysokokapacitní qPCR systém BioMark nám pomáhají zvládnout větší množství zakázek ve zkráceném čase bez nutnosti zapojit dalšího zkušeného laboratorního pracovníka.
Výhody automatizace:

  • Opakovatelnost – automatický systém má stále stejnou variabilitu, není zatížen chybou operátora
  • Umožňuje efektivnější využití času
  • Sníží se cena plastického spotřebního materiálu
  • Robotický systém neztrácí koncentraci a nejde ho vyrušit

Video

Automatické pipetování a příprava ředících řad s epMotion P5073 (Eppendorf)

Přístroj pro izolaci nukleových kyselin Quiacube, pipetovací robot EpMotion 5073 a vysokokapacitní qPCR systém BioMark nám pomáhají zvládnout větší množství zakázek ve zkráceném čase bez nutnosti zapojit dalšího zkušeného laboratorního pracovníka.
Výhody automatizace:

  • Opakovatelnost – automatický systém má stále stejnou variabilitu, není zatížen chybou operátora
  • Umožňuje efektivnější využití času
  • Sníží se cena plastického spotřebního materiálu
  • Robotický systém neztrácí koncentraci a nejde ho vyrušit

Video

Reference a publikace

CONNECTION TO INTERNATIONAL RESEARCH INFRASTRUCTURES OR CONSORTIA

  • SPIDIA: EU consortium for the standardisation and improvement of pre-analytical procedures for in-vitro diagnostics
  • cooperation with companies: TATAA Biocenter, Bio-Rad, Eppendorf, Qiagen, Roche
  • cooperation with universities: Technische Universität München, Germany; Tun Abdul Razak Research Centre London, England; Erasmus University Rotterdam, Netherlands; The University of Queensland, Brisbane, Australia

 

SELECTED REFERENCES ON METHODOLOGY

  • The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. Clin Chem. 2009 Apr;55(4):611-22.
  • Gene expression profiling–Clusters of possibilities. Bergkvist A, Rusnakova V, Sindelka R, Garda JM, Sjögreen B, Lindh D, Forootan A, Kubista M. Methods. 2010 Apr;50(4):323-35.
  • Statistical aspects of quantitative real-time PCR experiment design. Kitchen RR, Kubista M, Tichopad A. Methods. 2010 Apr;50(4):231-6.
  • Correction of RT-qPCR data for genomic DNA-derived signals with ValidPrime. Laurell H, Iacovoni JS, Abot A, Svec D, Maoret JJ, Arnal JF, Kubista M. Nucleic Acids Res. 2012 Apr;40(7).
  • The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Huggett JF, Foy CA, Benes V, Emslie K, Garson JA, Haynes R, Hellemans J, Kubista M, Mueller RD, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT, Bustin SA. Clin Chem. 2013 Jun;59(6):892-902.
  • RT-qPCR work-flow for single-cell data analysis. Ståhlberg A, Rusnakova V, Forootan A, Anderova M, Kubista M. Methods. 2013 Jan;59(1):80-8.
  • The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Ståhlberg A, Kubista M. Expert Rev Mol Diagn. 2014 Apr;14(3):323-31.
  • Biomarkers for monitoring pre-analytical quality variation of mRNA in blood samples.Zhang H, Korenková V, Sjöback R, Švec D, Björkman J, Kruhøffer M, Verderio P, Pizzamiglio S, Ciniselli CM, Wyrich R, Oelmueller U, Kubista M, Lindahl T, Lönneborg A, Rian E. PLoS One. 2014 Nov 4;9(11).
  • Pre-amplification in the context of high-throughput qPCR gene expression experiment. Korenková V, Scott J, Novosadová V, Jindřichová M, Langerová L, Švec D, Šídová M, Sjöback R. BMC Mol Biol. 2015 Mar 11.

 

PUBLICATIONS WITH COOPERATION OF CF

2015

  • Pre-amplification in the context of high-throughput qPCR gene expression experiment. Korenková V, Scott J, Novosadová V, Jindřichová M, Langerová L, Švec D, Šídová M, Sjöback R. BMC Mol Biol. 2015 Mar 11;16:5. doi: 10.1186/s12867-015-0033-9.
  • Post-treatment recovery of suboptimal DNA repair capacity and gene expression levels in colorectal cancer patients. Slyskova J, Cordero F, Pardini B, Korenkova V, Vymetalkova V, Bielik L, Vodickova L, Pitule P, Liska V, Matejka VM, Levy M, Buchler T, Kubista M, Naccarati A, Vodicka P. Mol Carcinog. 2015 Sep;54(9):769-78. doi: 10.1002/mc.22141. Epub 2014 Mar 3.

2014

  • SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. Malentacchi F, Pazzagli M, Simi L, Orlando C, Wyrich R, Günther K, Verderio P, Pizzamiglio S, Ciniselli CM, Zhang H, Korenková V, Rainen L, Bar T, Kubista M, Gelmini S. PLoS One. 2014 Nov 10;9(11):e112293. doi: 10.1371/journal.pone.0112293. eCollection 2014.
  • Biomarkers for monitoring pre-analytical quality variation of mRNA in blood samples. Zhang H, Korenková V, Sjöback R, Švec D, Björkman J, Kruhøffer M, Verderio P, Pizzamiglio S, Ciniselli CM, Wyrich R, Oelmueller U, Kubista M, Lindahl T, Lönneborg A, Rian E. PLoS One. 2014 Nov 4;9(11):e111644. doi: 10.1371/journal.pone.0111644. eCollection 2014.
  • Molecular characteristics of mismatch repair genes in sporadic colorectal tumors in Czech patients. Vymetalkova VP, Slyskova J, Korenkova V, Bielik L, Langerova L, Prochazka P, Rejhova A, Schwarzova L, Pardini B, Naccarati A, Vodicka P. BMC Med Genet. 2014 Jan 31;15:17. doi: 10.1186/1471-2350-15-17.
  • Effect of zearalenone on reproductive parameters and expression of selected testicular genes in mice. Zatecka E, Ded L, Elzeinova F, Kubatova A, Dorosh A, Margaryan H, Dostalova P, Korenkova V, Hoskova K, Peknicova J. Reprod Toxicol. 2014 Jun;45:20-30. doi: 10.1016/j.reprotox.2014.01.003. Epub 2014 Jan 9.

2013

  • Evaluation of tumor suppressor gene expressions and aberrant methylation in the colon of cancer-induced rats: a pilot study. Polakova Vymetalkova V, Vannucci L, Korenkova V, Prochazka P, Slyskova J, Vodickova L, Rusnakova V, Bielik L, Burocziova M, Rossmann P, Vodicka P. Mol Biol Rep. 2013 Oct;40(10):5921-9. doi: 10.1007/s11033-013-2699-8. Epub 2013 Sep 25.
  • Association of obesity susceptibility gene variants with metabolic syndrome and related traits in 1,443 Czech adolescents. Dušátková L, Zamrazilová H, Sedláčková B, Včelák J, Hlavatý P, Aldhoon Hainerová I, Korenková V, Bradnová O, Bendlová B, Kunešová M, Hainer V. Folia Biol (Praha). 2013;59(3):123-33.
  • Microfluidic high-throughput RT-qPCR measurements of the immune response of primary bovine mammary epithelial cells cultured from milk to mastitis pathogens. Sorg D, Danowski K, Korenkova V, Rusnakova V, Küffner R, Zimmer R, Meyer HH, Kliem H. Animal. 2013 May;7(5):799-805. doi: 10.1017/S1751731112002315. Epub 2012 Dec 11.