Zde se nacházíte: Biocev / OMICS Genomika

OMICS Genomika

O nás

  • CF OMICS – GENOMIKA poskytuje servisní služby v oblasti sekvenace DNA a fragmentační analýzy DNA. S klasickým Sangerovým sekvenováním a metodami fragmentační analýzy máme dlouholeté zkušenosti, samostatná Laboratoř sekvenace DNA vznikla na Přírodovědecké fakultě UK již v roce 2003 (https://www.natur.cuni.cz/biologie/servisni-laboratore/laborator-sekvenace-dna).
  • Nabízíme také čtečku čipů (microarray scanner) Axon GenePix.
  • Nabízíme služby sekvenování druhé generace (NGS, Next-generation sekvenování) na platformě MiSeq, Illumina.
  • Provádíme kontrolu kvality DNA a RNA a knihoven pro NGS pomocí spektrofotometru Nanodrop,  fluorometru Quantus, Bioanalyzéru Agilent a metodami qPCR.
  • Připravujeme některé typy knihoven pro NGS (v současné době máme k dispozici TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit, Illumina a TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit, Illumina).

Klíčové výrazy

  • Sangerovo sekvenování
  • fragmentační analýza
  • sekvenování druhé generace (NGS, Next generation sekvenování)
  • MiSeq
  • kontrola kvality DNA a RNA

Aktuality

  • Užitečné informace a odkazy

    Naše primery: bližší informace ZDE

     

    ...pokračovat
  • Užitečné informace a odkazy

    Naše primery: bližší informace ZDE

     


Aktuality

  • Užitečné informace a odkazy

    Naše primery: bližší informace ZDE

     

    ...pokračovat
  • Užitečné informace a odkazy

    Naše primery: bližší informace ZDE

     

Ceník

 3500 Genetic Analyzer, Life Technologies

  • Sekvenační analýza s přípravou sekvenační reakce a přesrážením 100 Kč
  • Cena je stanovena za jednu sekvenační reakci s jedním primerem, kromě mezd a režií, zahrnuje alikvot sekvenačního kitu, plastik, chemikálie na přesrážení a formamid, polymer, pufr a opotřebení kapiláry.
  • Laboratořím mimo Univerzitu Karlovu je k ceně připočteno DPH 21%. 

 

  • Sekvenační analýza již hotového sekvenačního produktu 40 Kč
  • Cena je stanovena za jednu analýzu na genetickém analyzátoru, kromě mezd a režií zahrnuje formamid, plastik, polymer,pufr a opotřebení kapiláry.
  • Laboratořím mimo Univerzitu Karlovu je k ceně připočteno DPH 21%.

 

3130xl Genetic Analyzer, Life Technologies

  • Fragmentační analýza 40 Kč
  • Cena je stanovena za jednu analýzu na genetickém analyzátoru, kromě mezd a režií zahrnuje formamid, plastik, polymer, pufr a opotřebení kapiláry.
  • Laboratořím mimo Univerzitu Karlovu je k ceně připočteno DPH 21%.

 

MiSeq, Illumina

• Cena na vyžádání

 

Spektrofotometr Nanodrop 2000 UV-Vis spectrophotometr

• ZDARMA

 

Fluorometr Quantus

• 21 Kč za vzorek

 

Agilent 2100 Bioanalyzér

• Cena dle typu čipu na vyžádání (1200-1700 Kč)

 

M220 Focused-ultrasonicator™ – Covaris

• 200 Kč za vzorek, včetně sonikačních minizkumavek o objemu 50ul nebo 150ul

 

LightCycler 480 Real-TimePCR, Roche

• Cena na vyžádání

 

Čtečka čipů Axon GenePix

• ZDARMA

 

Tým a kontakt

Hrda
  • RNDr. Štěpánka Hrdá

  • DNA Sequencing laboratory, Faculty of science, Charles University in Prague
  • +420 325 873 935
  • +420 325 873 936
Místnost M1.012; J1.016
Místnost
M1.012; J1.016

Kde nás najdete v BIOCEV centru

Mapa1NP-OMICS


Vybavení


  • Bioanalyzér 2100, Agilent

    kontrola kvality nukleových kyselin

    k dispozici jsou kity:

    a) High Sensitivity DNA kit – pro kontrolu kvality DNA fragmentů a DNA knihoven ve velikosti 50-7000 bp. Tento kit obzvlášť slouží ke kontrole kvality a monitorování kritických kroků při přípravě knihoven pro NGS. Výhodou je vysoké citlivost (detekce už 5 pg/µl) a minimální spotřeba materiálu (pouze 1 µl vzorku).

    b) DNA 12000 – pro analýzu dsDNA fragmentů od 100-12000 bp

    c) RNA 6000 Nano – pro analýzu celkové RNA a mRNA v koncentraci 25-500 ng/µL. Poskytuje informace o stupni degradace celkové RNA (RIN).

     

    umístění v M1.023

  • Spektrofotometr Nanodrop 2000 UV-Vis spectrophotometr, Thermo Scientific

    rychlá kontrola kvantity a kvality DNA a RNA

    potřeba jen 1,5 – 2 ul

    použití vlastních špiček

    přístroj je na internetu

    umístění v M1.023, na vyžádání zapůjčíme přístupovou kartu

  • MiSeq, Illumina

  • 3500 Genetic Analyzer, Life Technologies

  • 3130xl Genetic Analyzer, Life Technologies

  • Fluorometr Quantus, Promega

    • kontrola kvantity nukleových kyselin
    • k dispozici jsou kity dsDNS, ssDNA, RNA
    • umístění v M1.023
  • LightCycler 480 Real-TimePCR, Roche

    kontrola kvantity DNA knihovny pro Next-Generation sekvenování metodou qPCR pomocí NEBNext® Library Quant Kit for Illumina®

    ve spolupráci s laboratoří Doc. Mgr. Pavla Stopky, Ph.D.

    umístění v A2.037

  • M220 Focused-ultrasonicator™, Covaris

    fragmentování DNA pro Next-Generation sekvenování

    umístění v M1.023

  • Čtečka čipů GenePix 4000B, Axon

    detekce fluorescenčních signálů z DNA čipů

    ve spolupráci s laboratoří Prof. Zdenou Palkovou, Ph.D.

    umístění v L1.009

Naše služby

Sangerovo sekvenování DNA

  • Nabízíme sekvenaci plasmidů a PCR produktů zahrnující sekvenační reakci a analýzu na genetickém analyzátoru ABI 3500 Life Technologies.
ABI 3500 Life Technologies

ABI 3500 Life Technologies

  • Vzorky k analýze lze nechávat přímo na recepci Biocev ve sběrné schránce připevněné na zdi. Další sběrné místo je na Přírodovědecké fakultě UK ve Viničné 7 ve II. suterénu (označená lednička na chodbě vedle výtahu vpravo). Vzorky lze též posílat poštou na adresu: Štěpánka Hrdá, Core facility – Genomika, PřF UK, Biocev, Průmyslová 595, Vestec, 252 50.
  • Opakované analýzy na genetickém analyzátoru provádíme zdarma. Samotnou sekvenační reakci nelze opakovat, připravené vzorky stačí na jednu sekvenační reakci a při jejím selhání je nutno zaslat nové vzorky.
  • Výsledky odesíláme e-mailem ve formatu *.ab1 (chromatogram) a *.seq většinou do dvou pracovních dnů.

Příprava vzorků

  • Vzorky připravujte do 0,2 ml tenkostěnných mikrozkumavek, do stripů nebo do platíčka (pipetujte prosím vertikálně, viz. obrázek).

obrazek

  • Zvláště při větším počtu jednotlivých zkumavek použijte pořadová čísla z průvodky a zkumavky vyrovnejte do stojánku, na karton či podobně (stojánky samozřejmě vracíme, stačí si je podepsat a vyzvednout).
  • Celkový objem vzorku je 8 μl = 5 pmol jednoho primeru (Tm 50-55°C opt., Tm 45-72°C max.) + DNA v množství 5ng/100pb u PCR produktů nebo 3ng/100pb plasmidové DNA (započítává se celá délka plasmidu, odpovídá to asi 100-200ng DNA do reakce, max. však 300ng u velkých plasmidů) + voda (kvalitní, v žádném případě TE pufr – blokuje reakci). Pozor – navyšování množství DNA vede i k navyšování nečistot ve vzorku a sekvenační reakce pak může být blokována! V případě problémů můžete zaslat DNA a primery zvlášť – přeměříme koncentraci a čistotu a namícháme vzorek sami.
  • Často používané primery můžeme do reakce přidat, v tom případě připravte vzorek do objemu 7 μl.
  • Vzorek pro sekvenaci musí být zbaven veškerých nečistot! Pro plasmidy je nejvhodnější použít miniprep kit. Problém může způsobit ethanol ve vzorku, takže je kolonku potřeba před elucí do vody 2x stočit a pořádně odvětrat (5 min). PCR produkty přečistěte buď pomocí kolonek nebo ethanolovou precipitací. Sami máme výbornou zkušenost se směsí na přečištění PCR produktů ExoSAP-IT™ a podobných produktů.
  • Pokud sekvenujete poprvé, začněte s malým počtem vzorků. S menším počtem začínejte i nové série, např. po delší době nebo s novými primery. Nejčastější problémy vznikají z důvodu nevhodně zvoleného primeru a špatné koncentrace či čistoty templátu. Návod na řešení nejčastějších problémů při sekvenaci najdete zde.
  • Průvodku ke vzorkům na sekvenační reakci a analýzu (Průvodka-reakce+analýza), nebo pouze na sekvenační analýzu (Průvodka-analýza  zasílejte na adresu seqlab@natur.cuni.cz
  • Průvodku, sáček se vzorky a předmět e-mailu označte stejně, a to zkratkou jména a datem (např. Štěpánka Hrdá – STH010112). Zkumavky se vzorky označujte zkratkou a pořadovým číslem podle průvodky (např. sth1). Názvy vzorků v průvodce mohou být jakékoli, musí ale začínat zkratkou jména (např. STH), smí obsahovat pouze povolené znaky -_ ., a nesmí obsahovat mezeru.
  • Pokud máte další požadavky, např. spěcháte na výsledky, chcete výsledky na jinou adresu, požadujete speciální podmínky (vyšší/nižší teplotu nasedání, možnou přítomnost vlásenky nebo HisTag sekvence, problémy při předchozí sekvenaci podobného vzorku, bisulfitové sekvenování, polyúseky, použití BigDye® Terminator v1.1 apod.), zapište je jak do průvodky, tak i do emailu.
  • Do průvodky nezapomeňte zmínit délku PCR fragmentu, respektive optimální požadovanou délku přečtené sekvence  insertu (do 400 bazí, do 700 bazí, co nejvíc) a také velikost vektoru.

Fragmentační analýza DNA

  • Za použití kapilárního genetického analyzátoru ABI 3130xl Life Technologies ABI 3130xl (Obr. 2) umístěného na Přírodovědecké fakultě UK provádíme elektroforetickou analýzu vašich DNA fragmentů, jako jsou produkty PCR, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length polymorphism),  MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) a další.

Obr.2-3130xl Genetic Analyzer

  • Sběrné místo je na Přírodovědecké fakultě UK, ve Viničné 7, II. suterénu (označená lednička na chodbě vedle výtahu vpravo). Vzorky k analýze lze také posílat poštou. Sáčky kromě vlastní značky označujte zkratkou FR. Snažíme se o rychlé zpracování výsledků, většinou do dvou pracovních dní, záleží na momentálním počtu přijatých vzorků. Opakované analýzy na genetickém analyzátoru provádíme zdarma.
  • Přístroj má nastaveny spektrální kalibrace se standardy:
    • DS-30 (6FAM™, HEX, NED™, ROX™) pro červený standard ROX400 a ROX500
    • DS-33 (6FAM™, VIC®, NED™, PET®, LIZ®) pro oranžový standard LIZ500, LIZ600 a LIZ1000
    • DS-02 (dR110, dR6G, dTAMRA™, dROX™, LIZ®) pro oranžový standard LIZ120  pro SNaPshoty
    • Další standardy lze instalovat po domluvě s klientem
  • Výsledky odesíláme e-mailem ve formatu *.fsa

Příprava vzorků

  • Vzorky připravujte do stripů nebo optických platíček (dostanete předem na vyžádání i s víčkem). Do platíčka pipetujte vzorky vertikálně, po sloupcích po 8!
  • Analýza běží na 16ti-kapiláře, snažte se proto, aby počet vzorků byl pokud možno násobkem šestnácti. V případě nižšího počtu vzorků čekáme na doplnění počtu alespoň na 10.
  • Vzorky (0,5 μl) namíchejte do formamidu (9 μl, i ten můžete dostat předem v laboratoři), přidejte vlastní standard (0,5 μl) a zdenaturujte – postupujte dle návodu výrobce.
  • Vnitřní standardy (ROX400, 500 a LIZ120, 600,1000) nedodáváme. Standard LIZ500 můžeme po dohodě přidat.
  • Průvodku ke vzorkům (ke stažení ZDE) zasílejte na adresu seqlab@natur.cuni.cz
  • Průvodku, sáček se vzorky a předmět e-mailu označte stejně, a to zkratkou jména a datem (např. Štěpánka Hrdá – STH010112). Zkumavky se vzorky označujte zkratkou a pořadovým číslem podle průvodky (např. sth1). Názvy vzorků v průvodce mohou být jakékoli, musí ale začínat zkratkou jména (např. STH), smí obsahovat pouze povolené znaky -_ ., a nesmí obsahovat mezeru.

Sekvenování druhé generace (NGS, Next generation sekvenování)

  • Na platformě MiSeq nabízíme možnost sekvenování jednak Vašich připravených knihoven a jednak knihoven, které jsme v omezeném množství schopni připravit z Vašich vzorků.
  • Sekvenování na této platformě umožňuje tvorbu clusterů, amplifikaci, sekvenování a primární analýzu dat v jednom přístroji.
  • Sekundární analýzu dat neprovádíme.
  • V současné době  máme k dispozici sekvenační kity:

MiSeq Reagent kit v2 (300cyklů)

MiSeq Reagent kit v3 (150cyklů)

  • Jiný typ sekvenačního kitu můžeme objednat, dodací lhůta cca 2-3 týdny
  • Kvalitu Vámi připravené DNA/RNA knihovny pro NGS si před sekvenováním vždy prověříme vhodnou metodou

Příprava DNA a RNA knihovny pro NGS

  • V současné době máme k dispozici tyto kity:
    • TruSeq Stranded Total RNA Library Preparation Kit, Illumina
    • TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit, Illumina

Stanovení kvality a kvantity DNA a RNA

Vzhledem k tomu, že nejpravděpodobnější příčinou selhání sekvenační reakce je špatná kvalita nebo koncentrace templátu nabízí naše CF k použití několik přístrojů pro měření kvantity a kvality DNA a RNA:

  • Spektrofotometr Nanodrop 2000UV-Vis spectrophotometr

Obr.4-Nanodrop 2000

  • Fluorometr Quantus

Obr.5-Quantus fluorometr

 

  • Agilent 2100 Bioanalyzér

agilent

 

  • LightCycler 480 Real-TimePCR, Roche

LightCycler 480 Real-TimePCR, Roche

 

 

 

 

Reference a publikace

POTENTIAL FOR COOPERATION

  • More than 12 years’ experience in capillary sequencing – more than 35 000 samples per year. Single read sequencing service for plasmids and PCR fragments. Fragment analysis (Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) Mapping, Microsatellite STR Analysis, SNP Genotyping).
    • High-throughput massive parallel sequencing on MiSeq – Illumina (RNA-Seq, De novo sequencing, Targeted resequencing). Library preparation.
    • Access to other equipment – Agilent 2100 Bioanalyser, Covaris M220.